Полиморфизм гена KAP1.1 у овец отечественного поголовья
Полиморфизм гена KAP1.1 у овец отечественного поголовья
Аннотация
Кератиновые белки являются фактором, обуславливающим шерстную продуктивность животных. Изменчивость гена KRTAP1.1, отвечающего за синтез белка KAP1.1, потенциально влияет на шерстные качества овец. В данной работы было оценено распределение полиморфизма данного гена у 10 популяций отечественных пород овец. По результатам исследования было выявлено преобладание аллеля B и генотипа BB в структуре изучаемых популяций. Аллель C был представлен в меньшей степени, в то время как аллель A практически отсутствовал у исследуемых животных. Наибольшим генетическим разнообразием по данному локусу отличались животные романовской, грозненской и кавказской пород овец, а наименьшим — куйбышевской. По распределению изучаемого полиморфизма популяции романовской и эдильбаевской пород достоверно отличались от остальных исследуемых пород.
1. Введение
Овцеводство на протяжении веков является одной из важнейших отраслей животноводства России и служит источником таких незаменимых продуктов, как мясо, шерсть и молоко. Шерсть овец используется для производства широкого спектра текстильной продукции, начиная от простых валяных изделий и заканчивая качественными дорогостоящими костюмами. Несмотря на повсеместный переход легкой промышленности на синтетическое сырье, ткани из натуральных волокон и овечья шерсть в особенности остаются востребованы благодаря их гигроскопичности, эластичности, мягкости, стойкости к накоплению запахов, способности держать тепло, при этом сохраняя вентилирующие качества, а также меньшим влиянием на экологию при производстве и переработке в сравнении с искусственными волокнами , .
Получение шерсти высокого качества требует использования современных методов селекции овец. Маркерная селекция (MAS — marker assisted selection), является одним из таких методов. В рамках данного метода проводится молекулярно-генетическая диагностика с целью выявления генетических маркеров тех или иных хозяйственно-полезных признаков животных.
Среди генов, контролирующих формирование шерстного волокна, выделяют KAP (keratin associated proteins), отвечающие за синтез белков матрикса, окружающего волокна кератина и KRT (keratins), непосредственно гены кератиновых волокон. Существует целый ряд исследований, которые показывают связь данных генов с тониной, изменчивостью тонины, длиной и прочностью штапеля, величиной настрига и другими качествами, учет которых важен при производстве текстильной промышленности .
Одним из маркеров, потенциально влияющих на шерстные качества овец, является KAP1.1. У овец ген KRTAP1.1 (ранее известный как B2A) расположен на 11 хромосоме . В норме KRTAP1.1 содержит четыре декапептидных последовательности вида QPTSIQTSCC, первоначально обозначенный Rogers G.R. с соавторами как QTSCCQPTSI , . Изменчивость данного гена характеризуется появлением двух возможных мутаций — одной инсерции и одной делеции длиной по 30 пар нуклеотидов, кодирующих вышеупомянутую аминокислотную последовательность, что приводит к возникновению трех аллельных вариаций KRTAP1.1 . Наличие этих мутаций у овец различных пород было отмечено в ряде работ. Так, в исследовании Itenge-Mweza T.O. с соавторами была отмечена полиморфность данного гена в популяции мериносов Новой Зеландии, и были выявлены все три аллельные вариации . В последующих работах этого же автора была показана достоверная связь этого полиморфизма с показателями выхода мытой шерсти и длиной штапеля , . В работе Ibrahim M.F. с соавторами был отмечен полиморфизм данного гена у египетских пород овец и его связь с показателями изменчивости тонины, настрига мытой шерсти, длины и прочности штапеля .
Цель данной работы — выявить полиморфизм по гену KAP1.1 у отечественных пород овец и оценить его распределение в структуре популяций.
2. Методы и принципы исследования
Для анализа были взяты пробы крови овец пород куйбышевская (популяции Кб-1 и Кб-2), дагестанская горная (популяции Дг-1 и Дг-2), романовская (популяции Рм-1 и Рм-2), кавказская, эдильбаевская, грозненская и черноземельский меринос. Из крови получали лейкоциты с последующим выделением ДНК с помощью наборов ДНК-Экстран 2 (Синтол, г. Москва). Полученный в результате ПЦР амплификат был проанализирован с использованием системы гель-документирования GelDoc XR+ (BioRad, США). Олигонуклеотиды для постановки ПЦР были произведены компанией Евроген (г. Москва). Последовательность праймеров согласно работе Itenge-Mweza T.O. с соавторами :
F: 5-CAA CCC TCC TCT CAA CCC AAC TCC-3 R: 5-GCT GCT ACC CAC CTG GCC ATA-3.
Программа амплификации:
95°C — 2 мин., 40 циклов (95°C — 20 сек., 62°C — 30 сек., 72°C — 30 сек.), 72°C — 5 мин.
Для проведения расчетов и создания рисунков были использованы программы: MS Excel, PopGen32, Genepop, MEGA и SPSS.
3. Основные результаты
В результате анализа были выявлены аллели A, B и C (ампликоны длиной 341, 311 и 281 п.н. соответственно) и их возможные сочетания: генотипы AA, AB, AC, BB, BC и CC. Результаты электрофоретического разделения полученных фрагментов представлены на рисунке 1. На рисунке 2 изображены гистограммы показателей индекса Шеннона и эффективного числа аллелей. Дендрограмма на основе генетического расстояния между популяциями изображена на рисунке 3. Частоты выявленных аллелей и генотипов представлены в таблице 1. В таблице 2 представлены популяционно-генетические показатели изучаемых популяций. Матрица с показателями уровня значимости (p) по результатам точного G-теста представлена в таблице 3. Показатели генетического сходства и расстояния представлены в таблице 4.
Пример полиморфизма длин полученных фрагментов в агарозном геле (3%)
1 и 4 дорожки содержат генотип BB, а 2 и 3 – генотипы BC и AB соответственно; M – дорожка маркера молекулярного веса (100 bp+1.5 Kb+3 Kb)
Гистограмма по показателям PIC, индекса Шеннона и эффективного числа аллелей
Круговая дендрограмма на основе генетического расстояния между популяциями
Таблица 1 - Распределение частот аллелей и генотипов гена KAP1.1 по 10 популяциям овец
Популяция | Частоты аллелей | Частоты генотипов | |||||||
A | B | C | AA | AB | AC | BB | BC | CC | |
Кб-1 (n=72) | 0,05 | 0,87 | 0,08 | 0,02 | 0,07 | 0 | 0,76 | 0,15 | 0 |
Кб-2 (n=68) | 0,01 | 0,89 | 0,1 | 0 | 0,03 | 0 | 0,79 | 0,16 | 0,02 |
Дг-1 (n=40) | 0,06 | 0,83 | 0,11 | 0,025 | 0,075 | 0 | 0,675 | 0,225 | 0 |
Дг-2 (n=35) | 0,03 | 0,78 | 0,19 | 0 | 0,057 | 0 | 0,629 | 0,257 | 0,057 |
Рм-1 (n=34) | 0,27 | 0,72 | 0,01 | 0,06 | 0,38 | 0,03 | 0,53 | 0 | 0 |
Рм-2 (n=40) | 0,2 | 0,76 | 0,04 | 0,025 | 0,35 | 0 | 0,55 | 0,075 | 0 |
Кавказская (n=63) | 0,02 | 0,75 | 0,23 | 0 | 0,03 | 0 | 0,62 | 0,24 | 0,11 |
Эдильбаевская (n=59) | 0,13 | 0,8 | 0,07 | 0,02 | 0,19 | 0,03 | 0,64 | 0,12 | 0 |
Черноземельская (n=42) | 0,06 | 0,82 | 0,12 | 0 | 0,12 | 0 | 0,67 | 0,19 | 0,02 |
Грозненская (n=36) | 0,08 | 0,75 | 0,17 | 0 | 0,16 | 0 | 0,53 | 0,28 | 0,03 |
Таблица 2 - Популяционно-генетические показатели
Популяция | Ho1 | He2 | Fis3 | ne4 | I5 | PIC6 | HWE7 |
Кб-1 | 0,22 | 0,23 | 0,02 | 1,29 | 0,46 | 0,23 | 0,26 |
Кб-2 | 0,19 | 0,2 | 0,04 | 1,25 | 0,39 | 0,20 | 0,58 |
Дг-1 | 0,3 | 0,31 | 0,01 | 1,43 | 0,58 | 0,28 | 0,21 |
Дг-2 | 0,31 | 0,35 | 0,1 | 1,53 | 0,6 | 0,34 | 0,73 |
Рм-1 | 0,41 | 0,42 | -0,003 | 1,7 | 0,65 | 0,40 | 0,41 |
Рм-2 | 0,43 | 0,38 | -0,13 | 1,61 | 0,65 | 0,36 | 0,76 |
Кавказская | 0,27 | 0,38 | 0,29 | 1,61 | 0,62 | 0,38 | 0,047 |
Эдильбаевская | 0,34 | 0,35 | 0,01 | 1,52 | 0,64 | 0,32 | 0,71 |
Черноземельская | 0,31 | 0,311 | -0,01 | 1,44 | 0,58 | 0,30 | 0,59 |
Грозненская | 0,44 | 0,41 | -0,1 | 1,67 | 0,72 | 0,38 | 0,74 |
Примечание: 1 – наблюдаемая гетерозиготность; 2 – ожидаемая гетерозиготность; 3 – индекс фиксации; 4 – эффективное число аллелей; 5 – информационный индекс Шеннона; 6 – показатель информативности полиморфизма; 7 – показатель уровня значимости (p) отклонения распределения генотипов от равновесного по закону Харди-Вайнберга
Таблица 3 - Показатели уровня значимости (p) по результатам точного G-теста
Популяция | Кб-1 | Кб-2 | Дг-1 | Дг-2 | Рм-1 | Рм-2 | Кавк. | Эд. | Черн. | Грозн. |
Кб-1 | 1 | 0,29 | 0,65 | 0,1 | 1,60e-05 | 0,002 | 0,004 | 0,09 | 0,55 | 0,1 |
Кб-2 | 0,29 | 1 | 0,20 | 0,2 | <2,00e-06 | 6,00e-06 | 0,019 | 0,0011 | 0,19 | 0,02 |
Дг-1 | 0,65 | 0,20 | 1 | 0,39 | 0,0007 | 0,012 | 0,071 | 0,28 | 1 | 0,57 |
Дг-2 | 0,1 | 0,2 | 0,39 | 1 | <2,00e-06 | 0,0003 | 0,66 | 0,01 | 0,43 | 0,42 |
Рм-1 | 1,60e-05 | <2,00e-06 | 0,0007 | <2,00e-06 | 1 | 0,51 | <2,00e-06 | 0,02 | 0,0004 | 0,0002 |
Рм-2 | 0,002 | 6,00e-06 | 0,012 | 0,0003 | 0,51 | 1 | <2,00e-06 | 0,25 | 0,008 | 0,006 |
Кавк, | 0,004 | 0,019 | 0,071 | 0,66 | <2,00e-06 | <2,00e-06 | 1 | 5,80e-05 | 0,07 | 0,08 |
Эд, | 0,09 | 0,0011 | 0,28 | 0,01 | 0,02 | 0,25 | 5,80e-05 | 1 | 0,19 | 0,13 |
Черн, | 0,55 | 0,19 | 1 | 0,43 | 0,0004 | 0,008 | 0,07 | 0,19 | 1 | 0,57 |
Грозн, | 0,1 | 0,02 | 0,57 | 0,42 | 0,0002 | 0,006 | 0,08 | 0,13 | 0,57 | 1 |
Таблица 4 - Показатели генетического сходства (сверху от диагонали) и расстояния (снизу от диагонали)
Поп-я | Кб-1 | Кб-2 | Дг-1 | Дг-2 | Рм-1 | Рм-2 | Кавк. | Эд. | Черн. | Грозн. |
Кб-1 | - | 0,9990 | 0,9986 | 0,9893 | 0,9542 | 0,9792 | 0,9776 | 0,9947 | 0,9983 | 0,9900 |
Кб-2 | 0,0010 | - | 0,9979 | 0,9920 | 0,9407 | 0,9698 | 0,9821 | 0,9900 | 0,9978 | 0,9896 |
Дг-1 | 0,0014 | 0,0021 | - | 0,9946 | 0,9557 | 0,9800 | 0,9856 | 0,9958 | 1,0000 | 0,9960 |
Дг-2 | 0,0107 | 0,0080 | 0,0054 | - | 0,9294 | 0,9596 | 0,9978 | 0,9833 | 0,9955 | 0,9973 |
Рм-1 | 0,0469 | 0,0611 | 0,0453 | 0,0733 | - | 0,9950 | 0,9100 | 0,9785 | 0,9538 | 0,9521 |
Рм-2 | 0,0210 | 0,0307 | 0,0202 | 0,0413 | 0,0050 | - | 0,9429 | 0,9941 | 0,9787 | 0,9753 |
Кавк. | 0,0226 | 0,0180 | 0,0145 | 0,0022 | 0,0944 | 0,0588 | - | 0,9707 | 0,9871 | 0,9931 |
Эд. | 0,0053 | 0,0101 | 0,0042 | 0,0168 | 0,0217 | 0,0059 | 0,0297 | - | 0,9913 | 0,9952 |
Черн. | 0,0017 | 0,0022 | 0,0000 | 0,0045 | 0,0473 | 0,0216 | 0,0130 | 0,0049 | - | 0,9966 |
Грозн. | 0,0100 | 0,0104 | 0,0040 | 0,0027 | 0,0491 | 0,0251 | 0,0069 | 0,0087 | 0,0034 | - |
4. Обсуждение
Как и в работах других исследователей, в структуре изучаемых популяций преобладал аллель B и генотип BB. Наибольшая их частота была замечена у куйбышевской породы, составляя 0,89 по содержанию аллеля B и 0,79 по содержанию генотипа BB в структуре популяции Кб-2. Наименьшая частота аллея B и генотипа BB наблюдалась у животных романовской (0,72 по аллелю B и 0,53 по генотипу BB у Рм-1) и грозненской (0,75 по аллелю B и 0,53 по генотипу BB) породы овец.
Гораздо более редкими оказались аллели A и C и содержащие их генотипы. Так, самое низкое содержание аллеля A наблюдалось у животных куйбышевской породы (0,01 у Кб-2), а самое высокое — у животных романовской породы (0,27 у Рм-1). Гомозиготный генотип AA отсутствовал у половины популяций, его наибольшая частота была отмечена у животных популяции Рм-1. Гетерозиготный генотип AB чаще всего встречался у животных романовской породы (0,38 у Рм-1), а его наименьшая частота была отмечена у кавказской породы (0,03) и куйбышевской породы (0,03 у Кб-2). Аллель C был представлен в наибольшей степени у животных кавказской породы (0,23) и в наименьшей степени у животных романовской породы (0,01 у Рм-1). Гомозиготный генотип CC, как и в случае с AA, присутствовал лишь у половины популяций, а его наибольшая частота составила 0,11 у животных кавказской породы. Гетерозиготный генотип BC в наибольшей степени был представлен у животных грозненской породы (0,28), а в наименьшей — у романовской породы, где у популяции Рм-2 его частота составила 0,075 (у Рм-1 генотип BC отсутствовал). Наиболее редкий генотип AC отсутствовал у большей части популяций и был обнаружен только у животных романовской и эдильбаевской пород (0,03 у обеих популяций).
При сравнении полученных данных с результатами зарубежных исследователей стоит отметить заметное преобладание аллеля B и генотипа BB в структуре популяций отечественных пород. Так, в турецком исследовании Yardibi H. с соавторами содержание аллеля B и генотипа BB в структуре популяций было заметно ниже, а наибольшее их содержание было отмечено у породы Kivircik (0,7 и 0,6 соответственно) . В работе Itenge-Mweza T.O. с соавторами от 2019 года частоты аллеля B и генотипа BB у африканской породы Swakara составили 0,57 и 0,35 соответственно . Таким образом, у исследуемых в данной работе животных минимальная частота аллеля B превышает максимальную частоту этого же аллеля у зарубежных пород.
Стоит также отметить, что наибольшее содержание аллеля A и генотипа AA наблюдается у пород овец, имеющих грубую шерсть (романовская, эдильбаевская), в то время как аллель C и генотип CC были больше представлены у пород, характеризующихся тонкой шерстью (дагестанская, черноземельская, кавказская, грозненская).
Все популяции находились в равновесном состоянии, согласно закону Харди-Вайнберга, за исключением кавказской породы овец, у которой показатель значимости точного теста был ниже порогового значения (0,05).
Для более точной оценки аллельных равновесий в популяциях были посчитаны показатели ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности, а также индекс фиксации (Fis), также известный как коэффициент инбридинга. За исключением кавказской и романовской (Рм-2) пород, все популяции имели близкие к нулю значения индекса фиксации, показывая незначительные различия между ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготностью. Рм-2 показала повышенную степень аутбридинга (-0,13). Кавказская порода показала высокий показатель индекса фиксации (0,29), что может свидетельствовать о значительной степени инбридинга в данной популяции. Тем не менее, данные по одному локусу и на довольно ограниченном объеме выборки недостаточно репрезентативны для однозначной оценки степени инбридинга по всей отаре.
Для более детальной оценки генетического разнообразия популяций были рассчитаны показатели PIC (информативность полиморфизма), индекса Шеннона (I) и эффективного числа аллелей (ne), по которым была построена гистограмма. При расчете обоих показателей за основу берутся частоты аллелей, но особенности расчета приводят к тому, что показатель I более чувствителен к наличию редких аллелей, в то время как PIC и ne сильно зависят от наличия доминирующих аллелей. В комплексе с наблюдаемой гетерозиготностью эти три показателя позволяют лучше оценить аллельное разнообразие популяции. К наиболее полиморфным популяциям можно отнести животных романовской, грозненской и кавказской пород. Чуть меньшие значения показали популяции эдильбаевской, черноземельской и дагестанской пород. Самым низким разнообразием обладали животные куйбышевской породы.
Для достоверной оценки отличий между популяциями был использован попарный точный G-тест. При заданном уровне значимости (0,0011 с поправкой Бонферрони) наиболее характерными отличиями от остальных популяций обладали животные романовской породы, которые достоверно отличались от большинства популяций.
По результатам оценки генетического расстояния популяции романовской породы были отнесены в отдельный кластер, а также, наряду с эдильбаевской, показали наибольшее отличие от остальных пород по исследуемому полиморфизму. Наибольшее расстояние отмечалось между романовской и кавказской породами овец. Стоит отметить, что характерное отличие романовской и эдильбаевской популяций от остальных исследуемых животных может быть обусловлено сельскохозяйственной направленностью данных пород. Так, и романовская, и эдильбаевская породы имеют грубую шерсть, тогда как для остальных исследуемых пород характерно тонкое и полутонкое руно.
5. Заключение
По итогам данной работы было выявлено, что у отечественных пород преобладет генотип BB и аллель B. В меньшей степени был представлен аллель C и генотипы BC и AB. Аллель A был представлен в наименьшей степени, а генотипы AA, AC и CC были найдены лишь у отдельных животных, либо отсутствовали. При этом достоверное отличие от остальных исследуемых популяций в распределении аллелей и генотипов было отмечено у обеих популяции романовской породы овец и у животных эдильбаевской породы овец, имевших в своей структуре наибольшую встречаемость аллеля A и содержащих его генотипов. Причиной тому, как отмечалось выше, может являться сельскохозяйственная направленность данных пород.
Все популяции, за исключением кавказской породы, находились в равновесном состоянии, согласно закону Харди-Вайнберга. Также у животных кавказской породы был отмечен высокий коэффициент инбридинга. Наиболее полиморфными по исследуемой мутации были животные романовской, грозненской и кавказской пород, в то время как животные куйбышевской породы обладали наименьшим разнообразием. По распределению генотипов и аллелей наиболее отличались от остальных популяций животные романовской породы.
Для более полной оценки данной мутации у отечественных пород рекомендуется увеличить объем исследуемых популяций, а также проверить связь данного полиморфизма с шерстными показатели продуктивности.