1. Введение

Овцеводство на протяжении веков является одной из важнейших отраслей животноводства России и служит источником таких незаменимых продуктов, как мясо, шерсть и молоко. Шерсть овец используется для производства широкого спектра текстильной продукции, начиная от простых валяных изделий и заканчивая качественными дорогостоящими костюмами. Несмотря на повсеместный переход легкой промышленности на синтетическое сырье, ткани из натуральных волокон и овечья шерсть в особенности остаются востребованы благодаря их гигроскопичности, эластичности, мягкости, стойкости к накоплению запахов, способности держать тепло, при этом сохраняя вентилирующие качества, а также меньшим влиянием на экологию при производстве и переработке в сравнении с искусственными волокнами [1], [11].

Получение шерсти высокого качества требует использования современных методов селекции овец. Маркерная селекция (MAS — marker assisted selection), является одним из таких методов. В рамках данного метода проводится молекулярно-генетическая диагностика с целью выявления генетических маркеров тех или иных хозяйственно-полезных признаков животных.

Среди генов, контролирующих формирование шерстного волокна, выделяют KAP (keratin associated proteins), отвечающие за синтез белков матрикса, окружающего волокна кератина и KRT (keratins), непосредственно гены кератиновых волокон. Существует целый ряд исследований, которые показывают связь данных генов с тониной, изменчивостью тонины, длиной и прочностью штапеля, величиной настрига и другими качествами, учет которых важен при производстве текстильной промышленности [3].

Одним из маркеров, потенциально влияющих на шерстные качества овец, является KAP1.1. У овец ген KRTAP1.1 (ранее известный как B2A) расположен на 11 хромосоме [9]. В норме KRTAP1.1 содержит четыре декапептидных последовательности вида QPTSIQTSCC, первоначально обозначенный Rogers G.R. с соавторами как QTSCCQPTSI [7], [10]. Изменчивость данного гена характеризуется появлением двух возможных мутаций — одной инсерции и одной делеции длиной по 30 пар нуклеотидов, кодирующих вышеупомянутую аминокислотную последовательность, что приводит к возникновению трех аллельных вариаций KRTAP1.1 [10]. Наличие этих мутаций у овец различных пород было отмечено в ряде работ. Так, в исследовании Itenge-Mweza T.O. с соавторами была отмечена полиморфность данного гена в популяции мериносов Новой Зеландии, и были выявлены все три аллельные вариации [4]. В последующих работах этого же автора была показана достоверная связь этого полиморфизма с показателями выхода мытой шерсти и длиной штапеля [5], [6]. В работе Ibrahim M.F. с соавторами был отмечен полиморфизм данного гена у египетских пород овец и его связь с показателями изменчивости тонины, настрига мытой шерсти, длины и прочности штапеля [2].

Цель данной работы — выявить полиморфизм по гену KAP1.1 у отечественных пород овец и оценить его распределение в структуре популяций.

2. Методы и принципы исследования

Для анализа были взяты пробы крови овец пород куйбышевская (популяции Кб-1 и Кб-2), дагестанская горная (популяции Дг-1 и Дг-2), романовская (популяции Рм-1 и Рм-2), кавказская, эдильбаевская, грозненская и черноземельский меринос. Из крови получали лейкоциты с последующим выделением ДНК с помощью наборов ДНК-Экстран 2 (Синтол, г. Москва). Полученный в результате ПЦР амплификат был проанализирован с использованием системы гель-документирования GelDoc XR+ (BioRad, США). Олигонуклеотиды для постановки ПЦР были произведены компанией Евроген (г. Москва). Последовательность праймеров согласно работе Itenge-Mweza T.O. с соавторами [7]:

F: 5-CAA CCC TCC TCT CAA CCC AAC TCC-3 R: 5-GCT GCT ACC CAC CTG GCC ATA-3.

Программа амплификации:

95°C — 2 мин., 40 циклов (95°C — 20 сек., 62°C — 30 сек., 72°C — 30 сек.), 72°C — 5 мин.

Для проведения расчетов и создания рисунков были использованы программы: MS Excel, PopGen32, Genepop, MEGA и SPSS.

3. Основные результаты

В результате анализа были выявлены аллели A, B и C (ампликоны длиной 341, 311 и 281 п.н. соответственно) и их возможные сочетания: генотипы AA, AB, AC, BB, BC и CC. Результаты электрофоретического разделения полученных фрагментов представлены на рисунке 1. На рисунке 2 изображены гистограммы показателей индекса Шеннона и эффективного числа аллелей. Дендрограмма на основе генетического расстояния между популяциями изображена на рисунке 3. Частоты выявленных аллелей и генотипов представлены в таблице 1. В таблице 2 представлены популяционно-генетические показатели изучаемых популяций. Матрица с показателями уровня значимости (p) по результатам точного G-теста представлена в таблице 3. Показатели генетического сходства и расстояния представлены в таблице 4.

4. Обсуждение

Как и в работах других исследователей, в структуре изучаемых популяций преобладал аллель B и генотип BB. Наибольшая их частота была замечена у куйбышевской породы, составляя 0,89 по содержанию аллеля B и 0,79 по содержанию генотипа BB в структуре популяции Кб-2. Наименьшая частота аллея B и генотипа BB наблюдалась у животных романовской (0,72 по аллелю B и 0,53 по генотипу BB у Рм-1) и грозненской (0,75 по аллелю B и 0,53 по генотипу BB) породы овец.

Гораздо более редкими оказались аллели A и C и содержащие их генотипы. Так, самое низкое содержание аллеля A наблюдалось у животных куйбышевской породы (0,01 у Кб-2), а самое высокое — у животных романовской породы (0,27 у Рм-1). Гомозиготный генотип AA отсутствовал у половины популяций, его наибольшая частота была отмечена у животных популяции Рм-1. Гетерозиготный генотип AB чаще всего встречался у животных романовской породы (0,38 у Рм-1), а его наименьшая частота была отмечена у кавказской породы (0,03) и куйбышевской породы (0,03 у Кб-2). Аллель C был представлен в наибольшей степени у животных кавказской породы (0,23) и в наименьшей степени у животных романовской породы (0,01 у Рм-1). Гомозиготный генотип CC, как и в случае с AA, присутствовал лишь у половины популяций, а его наибольшая частота составила 0,11 у животных кавказской породы. Гетерозиготный генотип BC в наибольшей степени был представлен у животных грозненской породы (0,28), а в наименьшей — у романовской породы, где у популяции Рм-2 его частота составила 0,075 (у Рм-1 генотип BC отсутствовал). Наиболее редкий генотип AC отсутствовал у большей части популяций и был обнаружен только у животных романовской и эдильбаевской пород (0,03 у обеих популяций).

При сравнении полученных данных с результатами зарубежных исследователей стоит отметить заметное преобладание аллеля B и генотипа BB в структуре популяций отечественных пород. Так, в турецком исследовании Yardibi H. с соавторами содержание аллеля B и генотипа BB в структуре популяций было заметно ниже, а наибольшее их содержание было отмечено у породы Kivircik (0,7 и 0,6 соответственно) [12]. В работе Itenge-Mweza T.O. с соавторами от 2019 года частоты аллеля B и генотипа BB у африканской породы Swakara составили 0,57 и 0,35 соответственно [8]. Таким образом, у исследуемых в данной работе животных минимальная частота аллеля B превышает максимальную частоту этого же аллеля у зарубежных пород.

Стоит также отметить, что наибольшее содержание аллеля A и генотипа AA наблюдается у пород овец, имеющих грубую шерсть (романовская, эдильбаевская), в то время как аллель C и генотип CC были больше представлены у пород, характеризующихся тонкой шерстью (дагестанская, черноземельская, кавказская, грозненская).

Все популяции находились в равновесном состоянии, согласно закону Харди-Вайнберга, за исключением кавказской породы овец, у которой показатель значимости точного теста был ниже порогового значения (0,05).

Для более точной оценки аллельных равновесий в популяциях были посчитаны показатели ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности, а также индекс фиксации (Fis), также известный как коэффициент инбридинга. За исключением кавказской и романовской (Рм-2) пород, все популяции имели близкие к нулю значения индекса фиксации, показывая незначительные различия между ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготностью. Рм-2 показала повышенную степень аутбридинга (-0,13). Кавказская порода показала высокий показатель индекса фиксации (0,29), что может свидетельствовать о значительной степени инбридинга в данной популяции. Тем не менее, данные по одному локусу и на довольно ограниченном объеме выборки недостаточно репрезентативны для однозначной оценки степени инбридинга по всей отаре.

Для более детальной оценки генетического разнообразия популяций были рассчитаны показатели PIC (информативность полиморфизма), индекса Шеннона (I) и эффективного числа аллелей (ne), по которым была построена гистограмма. При расчете обоих показателей за основу берутся частоты аллелей, но особенности расчета приводят к тому, что показатель I более чувствителен к наличию редких аллелей, в то время как PIC и ne сильно зависят от наличия доминирующих аллелей. В комплексе с наблюдаемой гетерозиготностью эти три показателя позволяют лучше оценить аллельное разнообразие популяции. К наиболее полиморфным популяциям можно отнести животных романовской, грозненской и кавказской пород. Чуть меньшие значения показали популяции эдильбаевской, черноземельской и дагестанской пород. Самым низким разнообразием обладали животные куйбышевской породы.

Для достоверной оценки отличий между популяциями был использован попарный точный G-тест. При заданном уровне значимости (0,0011 с поправкой Бонферрони) наиболее характерными отличиями от остальных популяций обладали животные романовской породы, которые достоверно отличались от большинства популяций.

По результатам оценки генетического расстояния популяции романовской породы были отнесены в отдельный кластер, а также, наряду с эдильбаевской, показали наибольшее отличие от остальных пород по исследуемому полиморфизму. Наибольшее расстояние отмечалось между романовской и кавказской породами овец. Стоит отметить, что характерное отличие романовской и эдильбаевской популяций от остальных исследуемых животных может быть обусловлено сельскохозяйственной направленностью данных пород. Так, и романовская, и эдильбаевская породы имеют грубую шерсть, тогда как для остальных исследуемых пород характерно тонкое и полутонкое руно.

5. Заключение

По итогам данной работы было выявлено, что у отечественных пород преобладет генотип BB и аллель B. В меньшей степени был представлен аллель C и генотипы BC и AB. Аллель A был представлен в наименьшей степени, а генотипы AA, AC и CC были найдены лишь у отдельных животных, либо отсутствовали. При этом достоверное отличие от остальных исследуемых популяций в распределении аллелей и генотипов было отмечено у обеих популяции романовской породы овец и у животных эдильбаевской породы овец, имевших в своей структуре наибольшую встречаемость аллеля A и содержащих его генотипов. Причиной тому, как отмечалось выше, может являться сельскохозяйственная направленность данных пород.

Все популяции, за исключением кавказской породы, находились в равновесном состоянии, согласно закону Харди-Вайнберга. Также у животных кавказской породы был отмечен высокий коэффициент инбридинга. Наиболее полиморфными по исследуемой мутации были животные романовской, грозненской и кавказской пород, в то время как животные куйбышевской породы обладали наименьшим разнообразием. По распределению генотипов и аллелей наиболее отличались от остальных популяций животные романовской породы.

Для более полной оценки данной мутации у отечественных пород рекомендуется увеличить объем исследуемых популяций, а также проверить связь данного полиморфизма с шерстными показатели продуктивности.

The additional file for this article can be found as follows: